●前言
欧易/鹿明生物客户南京大学地球科学与工程学院孙媛媛教授团队在ScienceoftheTotalEnvironment期刊发表了题为“的研究成果，该研究以土壤栽培的黄瓜(Cucumissativus)为试验对象，运用GC-MS代谢组学研究了全氟辛酸（PFOA）对黄瓜的光合作用和抗氧化能力等的影响。并利用GC-MS对黄瓜组织进行代谢组学研究，揭示了全氟辛酸（PFOA）对植物毒性的机理，对于今后对农业土壤中全氟辛酸（PFOA）的风险评估提供了重要依据。
中文标题：黄瓜(Cucumissativus)对全氟辛酸的光合作用和代谢组学响应
研究对象：黄瓜组织
发表期刊：ScienceoftheTotalEnvironment
影响因子：6.
合作单位：南京大学地球科学与工程学院
运用关键技术：GC-MS非靶向代谢组学
文章中GC-MS非靶向代谢组学由欧易/鹿明生物提供技术支持
●研究背景
全氟辛酸（PFOA）是一种普遍存在的合成化学物质，其在工业、商业和人们的日常消费品中的广泛应用会引起严重的环境污染问题，最终威胁生态环境安全及人体健康。研究表明，PFOA在环境中长时间的停留可能会导致PFOA从土壤向作物的累积，转移并存储在各种植物器官中，从而影响作物生长。
目前对于PFOA的不利影响和风险的研究多集中在水生生态系统和动物实验上，对土壤中PFOA如何影响植物生长，以及植物如何应对PFOA胁迫的了解尚少。此外，研究发现PFOA积累可引起氧化应激，从而影响细胞代谢。但是，其潜在的毒性机制在很大程度上尚未明确，故需要对PFOA毒性的评估及其对陆地生态系统的潜在影响的能力进行深入探究。
●研究技术路线
●实验方法
1.实验分组及前处理
从农田收集的土壤中施加0、0.2和5mg/kg（土壤）的有放射性标记的PFOA-[1-C](C-PFOA)，添加了PFOA的土壤置于盆中进行黄瓜栽培，PFOA处理24h后播种黄瓜种子。共有3种处理方式，包括对照组（无PFOA），0.2mg/kg的PFOA处理组，以及5mg/kg的PFOA处理组，每个处理组都有4个生物学重复（样本策略）。播种前采集土壤样品进行了放射性分析，0.2和5mg/kg处理的PFOA初始浓度分别为0.22和4.82mg/kg。
2.检验方法
（1）生物量测定：发芽60天后收获植株，洗净并分离成根、茎、叶部分，冻干后测定黄瓜生物量。
（2）PFOA含量检测：通过测量放射性C来评估土壤和植物中PFOA的浓度；
（3）光合指标分析：用分光光度法测定叶片中叶绿素含量。用Li-Cor便携式光合系统测定叶片的净光合速率、气孔导度、胞间CO浓度和蒸腾速率；
（4）代谢组学分析：GC-MS非靶向代谢组学
●研究方法及结果
1.C-PFOA的积累和黄瓜的生物量检测
C-PFOA的积累：本研究采用C放射性示踪剂跟踪植物组织对PFOA的吸收和转运。结果表明，即使在低浓度下，PFOA也会对土壤和植物产生影响（图1）。栽培土壤中添加PFOA的黄瓜的所有组织中都发现了C标记的化学物质，叶片中含量最高，其次是根和茎。
图1
经0(control)、0.2和5mg/kgPFOA处理的土壤栽培60天黄瓜根、茎、叶中C-化合物浓度
黄瓜的生物量检测：PFOA处理下黄瓜的平均生物量均低于对照组（图2），但0.2mg/kg和5mg/kg处理之间的生物量差异并不显著，说明影响黄瓜生长的因素除剂量效应外，还有其他因素。
图2
经0(control)、0.2和5mg/kgPFOA处理的土壤栽培60天后黄瓜根、茎、叶的干重
2.黄瓜对PFOA的光合响应
为了解叶片中全氟辛酸的积累对叶绿素含量和光合作用影响，进行了光合指标的分析。结果表明，与对照相比，PFOA显著降低了光合色素（Chla、Chlb和Caro）的含量（图3）。另外，通过气体交换分析，评价了光合作用对PFOA的响应。结果表明，经PFOA处理的叶片，其细胞间CO浓度（Ci；图4B）、蒸腾速率（Tr；图4C）或气孔导度（Gs；图4D）并无显著性差异。但是，在经0.2和5mg/kgPFOA处理的黄瓜中发现净光合速率下降。与PFOA处理过的生物量变化相同，经0.2mg/kg和5mg/kg处理的叶绿素含量和净光合速率的差异并不显著。
图3
经(control)、0.2和5mg/kgPFOA处理的土壤栽培60天后黄瓜叶片中叶绿素（Chl,mg/g鲜重）含量
作者推测，叶绿素含量降低和净光合速率降低可以解释经PFOA处理的黄瓜生物量减少。在PFOA胁迫下，黄瓜植物可能会遭受活性氧（ROS）信号级联反应，导致光合作用下降，从而使得生长受限。
图4
经0(control)、0.2和5mg/kgPFOA处理的土壤栽培60天后黄瓜叶片
净光合速率（A;Pn;μmolmss），细胞间CO浓度（B;Ci;μmolmol），蒸腾速率（C;Tr;mmolms）和气孔导度（D;Gs;mmolms）
3.黄瓜对全氟辛酸（PFOA）的代谢响应
作者认为，上述叶绿素及光合指标等的生理变化可能源于细胞内代谢变化。作者使用GC-MS非靶向代谢组学方法，总共鉴定出种代谢物，基于质谱指纹和保留指数匹配对它们进行半定量。使用MetaboAnalyst通过主成分分析（PCA）进行了无监督的聚类分析。结果表明，低PFOA组（0.2mg/kg）与对照组之间没有明显的分离。然而，高PFOA组（5mg/kg）在第一主成分（PC1）上与对照组明显分离，解释率为23.8%。此外，在PCA模型中，0.2mg/kg和5mg/kgPFOA之间没有明显的分离。通过有监督的分类模型，低剂量和高剂量PFOA组与对照组明显分离（图5B）。这表明暴露于PFOA改变了黄瓜叶片的代谢产物谱。
图5C中展示了可以区分对照组及PFOA处理组的共35种代谢物的VIP得分图。其中，具有清除ROS能力酚类物质（1、2、4benzenetriol和1-hydroxyanthraquinone）和天然氨基酸（谷氨酸、谷氨酰胺、棕榈酸、苯丙氨酸和脯氨酸）发生了显著改变（p0.05），表明PFOA干扰了黄瓜体内碳氮代谢，造成了氧化胁迫。
作者推断，黄瓜植株可能通过增加酚类物质的合成来应对PFOA诱导的氧化应激，保护细胞免受伤害。另外，苯丙氨酸是抗氧化次生代谢物的前体。苯丙氨酸的减少可能激活了抗氧化防御途径，与酚类物质上调所起的作用相一致。此外，天冬氨酸和谷氨酸是许多其他氨基酸的前体，且谷氨酸是高等植物氨基酸代谢的中心分子，调节铵态氮，也是叶片叶绿素合成的前体。谷氨酰胺和谷氨酸的减少可能可以解释叶绿素含量的减少（图3）。脯氨酸作为一种植物非生物和生物逆境的缓解剂，其减少可能会抑制蛋白质的生物合成，从而抑制植物的生长（图2）。
图5
经0(control)、0.2和5mg/kgPFOA处理的土壤栽培60天后黄瓜叶片代谢谱的得分图
（A）主成分分析（PCA）和（B）偏最小二乘判别分析（PLS-DA）以及（C）VIP得分图。
4.PFOA扰动代谢通路
结果表明，低PFOA（0.2mg/kg）诱导扰动三个生物学途径，包括淀粉和蔗糖代谢、糖酵解和糖异生以及氨基糖和核苷酸糖代谢（表1）。所有这些被扰动的通路与糖代谢有关，表明碳固定通路改变响应PFOA的胁迫作用。相比之下，高PFOA（5mg/kg）时，淀粉和蔗糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢这两种代谢通路的扰动并不显著（p0.05，表1）。然而，高PFOA扰乱了异喹啉生物碱的生物合成途径，产生生物碱，植物防御病原菌和食草动物不可缺少的化合物。此外，高PFOA还干扰了苯丙氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、酪氨酸代谢和丙酮酸代谢这4个与氨基酸代谢密切相关的生物通路。这些代谢途径的变化是氮和碳水化合物代谢的核心，为高PFOA如何抑制黄瓜生长和营养提供了可能的解释。
表1
0.2mg/kg（低剂量）和5mg/kg（高剂量）PFOA暴露使得黄瓜叶片中受影响的生物代谢通路
作者认为，较低剂量的PFOA及其盐类可以诱导主动防御反应，而高剂量的PFOA可以抑制黄瓜叶中的氨基酸。图6总结概括了糖代谢途径的原理图，图7归纳了经PFOA处理后受到影响的代谢物，展示了暴露于PFOA的黄瓜叶片中糖类、酚类化合物和氨基酸的变化。由此可见，植物体内碳水化合物、酚类物质和氨基酸代谢紊乱在黄瓜对PFOA胁迫的响应中起着重要作用，也是导致光合作用和生物量最终下降的可能原因之一。
图6
暴露于PFOA的黄瓜叶片中糖、酚类和氨基酸的代谢途径示意图
图7
暴露于PFOA的黄瓜叶片中糖、酚类和氨基酸类物质的改变
●研究结论
本文作者使用了GC-MS非靶向代谢组学方法，对全氟辛酸（PFOA）暴露土壤栽培的黄瓜组织代谢途径变化进行了研究。本研究通过光合特性和代谢组学分析，阐明了PFOA对植物的胁迫表现为抑制光合色素和光合速率、激活抗氧化酚和抑制天然氨基酸的代谢。该研究为了解植物响应非生物胁迫的分子机制提供了信息，为开发全氟辛酸（PFOA）毒性生物标记物提供了重要依据。
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本文是一篇非常典型的使用GC-MS非靶向代谢技术研究应激条件下植物代谢途径的文章，作者系统地研究了在经PFOA处理的土壤中生长60天的黄瓜叶片发生的代谢途径重构，不仅考察了不同剂量水平PFOA暴露的影响，还特别研究了PFOA处理对黄瓜代谢产物特异性的影响。作者结合黄瓜生物量、光合指标分析及代谢分析，对PFOA引起的代谢物的差异进行了深入的研究，证据翔实，是一篇非常值得借鉴的非靶标代谢组学论文。
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文末看点｜lu
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上海鹿明生物科技有限公司多年来，一直专注于生命科学和生命技术领域，是国内早期开展以蛋白组学和代谢组学为基础的多层组学整合实验与分析的团队。
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