总蛋白提取是所有蛋白实验的根基。总蛋白样品中酶活是否尽量保留、SDS-PAGE条带泳道是否横平竖直、总蛋白定量是否准确、Westernblot信噪比高不高、条带是否清晰、重复性好不好都跟总蛋白提取的流程和质量息息相关。实际操作中涉及到的蛋白提取主要分为两类，非变性蛋白提取和变性蛋白提取。非变性提取获得的蛋白顾名思义保留了大部分蛋白的天然构象和生理活性，适合做免疫共沉淀、凝胶阻滞色谱测定蛋白大小、酶活测定等实验，也可以用于Westernblot。变性提取获得的蛋白只能用于不需要蛋白生理活性的实验，主要是SDS-PAGE、Westernblot、二维电泳和蛋白质谱分析等。
从动物细胞和组织中提取蛋白最通用、最出名的试剂是RIPA（Radio-immunoprecipitationassaybuffer），其主要成分是Tris和氯化钠，还有不同成分和浓度的表面活性剂，如TritonX-、SDS、NP-40以及脱氧胆酸钠。RIPA有不同版本，区别主要在表面活性剂的种类和浓度。与动物细胞不同，植物组织通常富含初级和次生代谢物，包括但不限于淀粉、氨基酸、寡糖、可溶多糖、多酚、类*酮、萜类、酰基糖苷、脂肪酸、叶绿素和类胡萝卜素等，这些化合物都会干扰蛋白提取并影响跑胶和WB的质量。因此植物总蛋白的提取往往需要优化提取液或者使用完全不同的方法。RIPA也可以直接用于植物组织，但效果并不是很好而且不同批次的实验之间不稳定。
常用的植物变性蛋白提取方法主要有SDS-PAGEloadingbuffer煮沸法、苯酚提取法、TCA丙酮沉淀法等，多年的实践让我最终倾心于TCA丙酮沉淀法提取变性总蛋白。此方法原本适用于二维电泳和蛋白质谱样品准备，由于步骤中包括多次丙酮洗涤，能够除去大量代谢物，因此获得的总蛋白质量非常高，蛋白得率也非常理想。
TCA，即三氯乙酸（Trichloroaceticacid，化学结构式见下图），是氯原子完全取代乙酸分子中的甲基氢得到的产物。氯原子具有很强的电负性，强烈地吸引羧基中的负电荷，因此TCA的酸性（pKa=0.77）比乙酸强一万倍以上，是名副其实的强酸。TCA的丙酮溶液能够使蛋白质变性沉淀，因此本方法绝大多数步骤中蛋白都以沉淀的形式存在（上清中不含蛋白！要与一般的蛋白提取方法有所区别），能够抵抗蛋白酶的降解。
1试剂准备
10%TCA丙酮溶液。称取10gTCA固体，用丙酮定容至mL，储存于-20℃。注意！TCA有特殊的气味，在空气中极易潮解，且具有极强的腐蚀性，务必谨慎快速操作，建议佩戴双层手套，如果沾到手套上应该立即摘掉并用大量肥皂水清洗。
丙酮，分析纯以上纯度，储存在-20℃预冷。需要在通风橱中操作TCA丙酮和纯丙酮。
mMPMSF储液或者其他蛋白酶抑制剂储液。PMSF是最常用的蛋白酶抑制剂（主要抑制丝氨酸蛋白酶），但其在水溶液中的半衰期只有30分钟，非常容易失效，因此要用异丙醇配制，工作浓度最低1mM起，一般过量使用且要经常补加。避光储存在室温或者-20℃，如果刚从冰箱取出，会有晶体析出，需要完全溶解后使用。
蛋白溶解液。此溶液版本较多，如果只是用于普通WB，使用9M尿素的水溶液（保存在室温）即可满足一般需求，也可以添加1~4%的CHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate）增加膜蛋白的溶解效率。其他版本有使用7M尿素和2M硫脲混合液的，有时还会添加DTT、CHAPS、Tris等，个人觉得有些浮夸，除非做等电聚焦，否则简单的配方就能满足基本要求了。
2TCA丙酮沉淀法提取总蛋白取新鲜的植物材料，在液氮中速冻，并研磨成粉末。研磨的细腻程度对蛋白的得率至关重要，越细越好。
在高质量的1.7~2.0mL离心管中分装大约mg粉末，加入1mL预冷的10%TCA丙酮以及1mM终浓度PMSF，立即涡旋1分钟混匀，置于冰上。植物材料中的叶绿素会被TCA丙酮萃取并变性，此时溶液呈现棕褐色。
每1mL提取液处理mg植物组织是合适的，最多不能超过mg。次生代谢比较旺盛、富含多糖多酚的组织，需要使用相对较多的提取液。建议使用高质量的进口品牌离心管，TCA丙酮溶液非常容易渗漏，腐蚀性很强容易伤手，有时甚至会将离心管的Sharpie笔标记擦去导致样品弄混，使用不漏的进口离心管可以避免很多麻烦。
PMSF是最基础的蛋白酶抑制剂，也可以使用罗氏蛋白酶抑制剂小药丸，使用时先用缓冲液配成高浓度储液。如果需要研究蛋白的磷酸化，需要添加磷酸酶抑制剂，最常用的磷酸酶抑制剂是氟化钠和原钒酸钠，限于篇幅这里不介绍储液配制。
准备一个超声水浴，加入纯净水和一些冰块制成冰水混合物，将离心管漂浮在水浴上，超声处理1~2分钟，随后剧烈涡旋1~2分钟，置于冰上。重复超声-涡旋步骤2~3次。此步骤有助于组织中的蛋白充分释放和沉淀，对蛋白的总产量影响很大。
将样品置于-20℃环境下充分沉淀4小时以上，也可以过夜沉淀。
离心机预冷至4℃以下，沉淀完全的样品于g下离心10~20分钟。如果离心机能调整减速速率的，将减速速率调至最低，因为离心后的沉淀十分疏松，减速度过高很容易离心刚结束沉淀就脱离了管壁。离心结束后，立即将上清小心吸出丢弃，不要吸到沉淀并尽量将上清吸净，如果等5分钟后再吸上清沉淀会很容易飘起。此时沉淀中主要是细胞壁碎片以及蛋白沉淀。吸出的TCA丙酮应该置于有机废液缸中正确处置。
向沉淀中加入1mL预冷的纯丙酮，涡旋1分钟清洗沉淀。不需要将所有沉淀团块打散。将样品置于-20℃冰箱中沉淀5~10分钟。
g低温离心10~20分钟，离心结束后，立即将上清尽量吸净。
再次重复6、7两步洗涤离心至少两次（总洗涤次数3次或以上），直至彻底除去酸性的TCA以及脂溶性代谢物（以叶绿素为指示），最后一次离心之后沉淀应为接近白色。
吸净上清后，打开离心管盖将样品置于通风橱中晾干，或者使用SpeedVac等真空旋转干燥设备（注意！抽真空时必须保持离心，否则溶剂爆沸会将沉淀弹出导致损失）。干燥至沉淀不互相黏连、呈自由移动的粉末状、离心管无明显丙酮气味即可，不要干燥过久否则蛋白溶解困难。也不能有明显丙酮残余，否则会大大降低蛋白溶解效率。
向沉淀中加入9M尿素溶液，起始植物材料质量为mg时，使用μL尿素。剧烈涡旋1~2分钟，随后将离心管置于常温水浴中超声处理1~2分钟，室温静置5~10分钟。重复涡旋-超声-静置的过程，直至蛋白充分溶解，一般至少需要30分钟至1小时。
2倍体积的尿素溶液能够溶解沉淀中的绝大部分蛋白，同时不至于蛋白过于稀释。如果下游应用确实需要更高浓度的蛋白，可以减少尿素溶液至一倍体积，即每μL尿素溶解mg起始质量，但是这样做蛋白总得率会下降。
g室温离心10分钟以上，将所有不溶的细胞壁成分离心沉淀。小心地将上清吸到新的离心管中，不要吸到沉淀，此时得到的就是蛋白的尿素溶液。
按此法得到的蛋白中既没有表面活性剂（SDS、TritonX-等）也没有还原剂（DTT、巯基乙醇等），因此完美兼容Bradford、BCA等多种蛋白定量方法，且对蛋白质谱分析友好。按此法提取的蛋白浓度至少为2mg/mL。
3其它补充说明
蛋白电泳前，加入五分之一体积的6×SDS-PAGE上样缓冲液混匀（如何快速计算需要加多少上样缓冲液？点击阅读快速计算溶液稀释的口诀-稀释倍数），即可直接上样电泳。注意！含有尿素的蛋白溶液不能加热，温度超过30℃尿素会加速分解产生异氰酸，蛋白分子中的游离氨基会与之发生氨甲酰化反应。这对普通蛋白电泳影响不大，但在做蛋白质谱时碎片分子量会有所改变，如果你恰好研究蛋白的氨甲酰化水平，则有可能会得到错误的结论。氨基酸与尿素分解产物异氰酸发生氨甲酰化反应。