一、目的要求
学习果蔬组织中超氧阴离子产生速率的测定原理和方法。
二、基本原理
超氧阴离子（O2-）能与羟胺反应，生成NO2-，NO2-能与对氨基苯磺酸和α-萘胺反应生成粉红色的偶氮染料，该染料在波长nm处具有显著光吸收。因此利用羟胺氧化的方法可以测定果蔬组织中超氧阴离子产生速率。
O2-与羟胺的反应式如下：
NH2OH+2O2-+H+→NO2-+H2O2+H2O
可用KNO2制作标准曲线，以[NO2-]浓度乘以2作为[O2-]浓度，计算样品中O2-产生速率。
三、材料、仪器及试剂
（一）材料
苹果、梨、番茄、桃等。
（二）仪器及用具
研钵、高速冷冻离心机、移液器、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（mL、0mL）、分光光度计。
（三）试剂
1．mmol/L、pH7.8磷酸缓冲液
母液A（mmol/LNa2HPO4溶液）：称取35.61gNa2HPO4·2H2O或53.65gNa2HPO4·7H2O或71.64gNa2HPO4·12H2O，用蒸馏水溶解，定容至0mL。
母液B（mmol/LNaH2PO4溶液）：称取27.6gNaH2PO4·H2O或31.2gNaH2PO4·2H2O用蒸馏水溶解，定容至0mL。
取91.5mL母液A和8.5mL母液B混合后，调节pH至7.8，然后稀释至mL，即为mmol/L、pH7.8磷酸缓冲液。
2．50mmol/L、pH7.8磷酸缓冲液
3．提取缓冲液（含1mmol/LEDTA，0.3%TritonX-和2%PVP）
称取29.2mgEDTA、2gPVP，取0.3mLTritonX-，加入到50mmol/L、pH7.8磷酸缓冲液中，溶解定容至mL、混匀。
3．1mmol/L盐酸羟胺溶液
称取7.0mg盐酸羟胺，用蒸馏水溶解、定容至mL。
4．17mmol/L对氨基苯磺酸溶液
称取.4mg对氨基苯磺酸，用冰醋酸-水（3:1，v/v）溶解，并定容至mL。
5．7mmol/Lα-萘胺
称取.2mgα-萘胺，用冰醋酸-水（3:1，v/v）溶解，并定容至mL。
6．μmol/LKNO2标准溶液
称取85.1mgKNO2，用蒸馏水溶解、定容至mL，即为10mmol/LKNO2溶液。取1.0mL该溶液，稀释至mL，即为μmol/LKNO2标准溶液。根据前面的反应式，可计算得此溶液相当于μmol/L[O2-]。
四、实验步骤
（一）制作标准曲线
取7支试管，编号，按照表17分别加入各种试剂，摇匀。在25℃保温1h。取出后分别加入1.0mL17mmol/L对氨基苯磺酸和1.0mL7mmol/Lα-萘胺，混匀后再于25℃保温20min进行显色反应。以0号管为参比空白进行调零，立即测定显色液在波长nm处吸光度值。以吸光度值为纵坐标，超氧阴离子的量为横坐标，制作标准曲线。
表17．绘制KNO2标准曲线各试剂加入量
（二）提取
称取5.0g果蔬样品，加入5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨匀浆，于10×g、4℃离心20min，收集上清液进行测定。
（三）测定
取1.0mL上清液，加入1.0mL50mmol/L、pH7.8磷酸缓冲液和1.0mL1mmol/L的盐酸羟胺溶液，摇匀后于25℃保温1h。取出后加入1.0mL17mmol/L对氨基苯磺酸和1.0mL7mmol/Lα-萘胺，混匀后于25℃保温20min进行显色反应。按照与制作标准曲线相同的方法立即测定显色液在波长nm处吸光度值。
按照上述方法，但不进行保温1h的测定作为参比对照。重复三次。
五、实验结果与计算
根据样品管显色液与对照管显色液吸光度值的差值，从标准曲线上查处相应的超氧阴离子的量，以每分钟每克鲜重（FW）果蔬组织产生的超氧阴离子的纳摩尔数作为超氧阴离子的产生速率，表示为nmol·min-1·g-1FW。计算公式：
式中：
C——由标曲查得溶液中超氧阴离子的量，μmol；
V——样品提取液总体积，mL；
VS——吸取样品液体积，mL；
t——样品与羟胺反应的时间，min；
W——样品重量，g。
测得样品中蛋白质含量后，也可以nmol·min-1·mg-1蛋白质表示O2-的产生速率。
六、注意事项
1．也可以在显色反应保温后加入3.0mL正丁醇，充分摇动，静置分层后取正丁醇相在波长nm处测定吸光度值。
2．若样品中含有大量叶绿素时，可在样品与羟胺反应后，加入等体积的乙醚萃取叶绿素，然后再加入对氨基苯磺酸和α-萘胺进行的显色反应。