透过专利信息跟踪农业生物技术最新研究成果——年第42周篇
作者：莱肯生物
很多技术和产品的创新由于各种原因无法或暂时无法发表研究论文（高影响因子论文和高价值专利评判标准的不同、保持新颖性的需要、保密技术细节的需要等），因此公开的专利信息就是跟踪最新技术和产品的重要渠道。
然而，中国的专利年申请量已接近万件，如何从浩如烟海的专利资料中找寻到有价值的信息是一项具有挑战的工作。
本专栏将定期梳理最新公开的农业生物技术领域的发明专利，并就部分专利进行简单介绍，以为相关从业者提供有价值的信息参考。
今天让我们看看年第42周都公开了哪些农业生物技术相关的专利。
年第42周公开的
部分农业生物技术专利简介
关键词：SNP标记组合、大豆叶色、苜蓿基因编辑、原花色素合成
1、分子标记
双绿源创芯科技（佛山）有限公司、武汉双绿源创芯科技研究院有限公司和青岛双绿源依诺科技有限公司申请的专利106066587（发明人：邱树青;?丁怡雯;?冯芳;?李菁;?周发松）公开了一种用于水稻品种资源鉴定的SNP标记组合。本发明通过提取来源于世界各地的份核心种质水稻的重测序结果，开发出能将份水稻核心种质完全区分开的个SNP位点。上述SNP标记组合可用于水稻品种真实性和身份鉴定，具有适用的品种种类更多、低成本、高效率等优点。
河北省农林科学院粮油作物研究所申请的专利7（发明人：闫龙;?李曼;?张洁;?杨春燕;?邸锐;?史晓蕾;?刘兵强;?娜仁;?赵青松;?秦君;?王冬梅;?张孟臣）公开了32个大豆InDel标记在检测大豆遗传多样性中的应用。
本发明公开的32个大豆InDel标记为利用32对引物对大豆进行PCR扩增得到的32个DNA分子。利用这32个大豆InDel标记可以检测大豆遗传多样性，可以鉴定大豆品种或品系或开发鉴定大豆品种或品系的分子标记，还可以制备大豆遗传图谱，也可以还可以用于分析大豆的遗传结构，进一步还可以用于大豆育种。
山东大丰园农业有限公司和潍坊科技学院申请的专利106934（发明人：王彦娟;?周扬颜;?张欣;?尼秀媚;?吕金浮;?刘永光;?杨园园）公开了8种富士系列苹果特异性分子标记位点及其筛选方法和应用。
本发明按照简化基因组测序技术Super?GBS方法构建文库，文库质检合格后上机测序；对测序数据进行过滤后，筛选，验证，获得准确鉴定8种富士系列苹果的74个SNP标记位点，并筛选到几组能够高效鉴别8种富士系列苹果的SNP位点标记群。最终基于这些位点标记群开发出一种简便、快速、准确鉴定8种富士系列苹果的PCR鉴定方法。
湖南工业大学和中南林业科技大学申请的专利109787008（发明人：江南;?谭晓风;?周俊琴）公开了一种油茶自交不亲和关联基因、SNP标记及应用。CoMAPK9的基因组序列的OFR中SNP位置上存在SNP错义突变，碱基由C变成A，SNP位置上存在SNP错义突变，碱基由A变成G，两个位点SNP突变与油茶自交不亲和性状之间有显著相关性，表现为授粉后SNP位点基因型CC或CA的座果率显著高于基因型AA的座果率，授粉后SNP位点基因型AA或AG的座果率显著高于基因型GG的座果率。利用该基因SNP组合分子标记可进行油茶座果率表型苗期鉴定，有效提高油茶新造林地品种配置选择效率和油茶单位面积产量。
河北农业大学申请的专利106932391（发明人：马峙英;?张艳;?王省芬;?陈斌;?孙正文;?柯会锋;?吴立强;?张桂寅;?崔彦茹;?王国宁）涉及Dt11染色体区段及该区段包含的分子标记组合在调控棉花*萎病抗性中的应用。基于陆地棉核心种质*萎病抗性鉴定和全基因组关联分析，本发明将陆地棉抗*萎病主效位点定位在Dt11号染色体61.90?62.26Mb的kb的基因组区间内，该区段包含18个与*萎病抗性显著关联的SNP分子标记。具备优异SNP位点的新育成品种*萎病抗性表现优良，说明这些SNP分子标记可以用于棉花抗*萎病性状的早期预测和筛选，并且在棉花抗病新品种选育的领域具有重要意义。
2、大豆
中国农业科学院作物科学研究所申请的专利7（发明人：陈明;?马有志;?陈凯;?周永斌;?徐兆师;?陈隽）公开了植物耐逆性相关蛋白GmNTF2B?1及其编码基因与应用。通过实验证明：本发明的GmNTF2B?1可以提高植物的耐旱性，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。
南京农业大学申请的专利105837277（发明人：智海剑;?王丽群;?刘慧;?郭东全;?刘梦卓）公开了一个对大豆花叶病*具有抗性的基因GmGRX4及其应用。本发明利用VIGS使抗病品种科丰1号中的GmGRX4基因沉默后接种SC3株系，抗病品种科丰1号出现花叶症状。而在感病品种南农?2中过表达GmGRX4基因之后，接种SC3株系，南农?2对大豆花叶病*产生了抗性。证明GmGRX4基因的表达量降低能改变抗性品种的抗病性，GmGRX4基因的表达量提高能使感病品种获得抗性。利用转基因技术在感病品种中导入GmGRX4基因，可改良受体品种对大豆花叶病*的抗性。
中国农业科学院作物科学研究所申请的专利107783799（发明人：邱丽娟;?高华伟;?洪慧龙;?刘章雄）公开了一种控制大豆叶色相关基因紧密连锁标记与应用。
本发明利用EMS诱变ZP筛选获得的大豆*化突变体H为材料，通过叶绿素含量测定及叶绿体超微结构观察进行表型鉴定，利用ZP×H（F2）分离群体中的*、绿个体构池进行BSA?seq测序，并结合分离群体进行连锁分析确认区间；针对候选基因的变异位点开发dCAPS标记H?5，利用开发的dCAPS标记鉴定ZP×H（F2）群体获得基因型数据，鉴定了标记的准确性及可靠性。
3、水稻
电子科技大学申请的专利3（发明人：张勇;?周建平;?郑雪莲;?全泉;?秦鹏程）和8（发明人：郑雪莲;?张勇;?周建平;?李倩;?全泉;?唐旭）涉及一种改良水稻籽粒性状的方法。
该方法利用基因编辑方法阻断或者减弱水稻中OsMIR或OsMIR的表达，从而达到提高水稻籽粒性状的效果。
中国农业科学院生物技术研究所申请的专利107641622（发明人：谷晓峰;?李秀兰;?王晓蕾）公开了一种水稻RNAm5C甲基转移酶及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，命名为Osnsun6蛋白，获自水稻。Osnsun6蛋白可调控植物对热胁迫的耐逆性。本发明可用于植物的耐热性、籽粒性状以及RNAm5C修饰水平的改良。
4、耐旱
河南大学申请的专利102690482（发明人：王道杰;?陈玉平;?杨翠玲;?刘雷迪;?王勇锋;?席梦微;?丁群英）涉及一种油菜耐旱性负调控基因及其应用。本发明提供的油菜耐旱性负调控基因BnNAC在抗旱上起负调控作用，转基因植物中其过量表达会抑制编码参与非生物胁迫诱导的渗透或氧化损伤的响应基因表达，使转基因植物抗旱能力降低，为后续培育耐旱转基因作物提供理论依据和相关基因。
华中农业大学申请的专利107958986（发明人：代明球;?孙霄鹏;?向艳丽;?豆楠楠）公开了一种玉米抗旱基因ZmMYBR38及其应用。本发明验证了玉米抗旱基因ZmMYBR38在玉米抗旱性的功能，为通过分子育种方式进行玉米抗旱品种的培育提供了有价值的资源。
5、其他
中国农业大学申请的专利10884895X（发明人：王涛;?董江丽;?叶沁怡）公开了CRISPR/Cas9基因组编辑系统在紫花苜蓿基因编辑中的应用。本发明根据紫花苜蓿同源四倍体的特点对靶标基因设计双靶点，构建基因编辑双元载体p?Target，由农杆菌介导转化紫花苜蓿获得再生植株。这种优化的基因组编辑系统大大提高了紫花苜蓿基因编辑效率，植株基因编辑效率可高达%，单个靶点编辑效率可高达96.9%。
中国农业科学院北京畜牧兽医研究所申请的专利6（发明人：江文波;?庞永珍;?魏解冰）提供一种提高植物原花色素生物合成的方法及其应用。通过使植物体过量表达CsANR2基因、PAP1基因和CsF3’5’H基因，或过量表达CsANR2基因和PAP1基因，或过量表达CsANR2基因，使植物中的原花色素含量增加，解决了植物体中原花色素含量过低的问题，而且本发明为提高植物体中原花色素的含量提供了一种切实可行的途径，方法简单，对畜牧业具有重大意义。
结案专利详察
孟山都技术公司申请的专利《提高植物转化效率的多个转化增强子序列的应用X》（发明人：X·叶;?L·吉尔伯森）经过实质审查后于年3月8日以权利要求超出了说明书公开的范围为由被驳回。申请人于年6月23日请求复审，合议组经过审查，认为该发明不具备创造性，因此最终于年11月15日做出了维持原驳回决定的审查决定。今天，就让我们详细看看这个专利。
1、发明内容
本发明涉及提高农杆菌（Agrobacterium）和根瘤菌（Rhizobium）介导的植物细胞转化效率的方法和组合物，通过使用可操作地连接到包含T-DNA的重组构建体上的T-DNA边界序列上的附加转化增强子序列例如超驱动序列或者TSS序列可实现上述转化效率提高。
本发明是6专利的分案申请。
2、驳回决定
国家知识产权局原审查部门经实质审查于年3月8日以权利要求1-6、8-10超范围为由驳回了本申请。其中，驳回决定所针对的权利要求1的具体表述如下：
“1.一种提高根瘤菌介导的植物转化效率的方法，其包括：用根瘤菌转化植物细胞，所述根瘤菌包含含有至少一个来自根瘤农杆菌的T-DNA边界序列和与所述T-DNA边界序列可操作地连接的转化增强子序列的植物转化载体，其中所述转化增强子序列包含两个或更多个拷贝的SEQIDNO:6或SEQIDNO:6的全长互补序列”。
驳回决定中指出：权利要求1请求保护一种提高根瘤菌介导的植物转化效率的方法，本申请要解决的技术问题是提高细菌介导的植物转化效率的方法。本申请实施例仅证实了18×TSS序列的植物转化载体可提高转化效率，并没有对其他不同拷贝数的TSS序列的功能进行验证，并且，本申请说明书也未记载18×TSS序列提高转化效率的具体机制，如提高植物转化效率的最小结构单元。而根据对比文件2（AT-DNAtransferstimulationsequenceinthevicinityoftherightborderofpRi.GenevieveHansen等,PlantMolecularBiology,第20卷，第-页）可知，并非任意拷贝数的8bp重复单元序列均可以起到提高植物转化效率的作用，将天然发根农杆菌质粒T-DNA区右边界存在的TSS重复序列拷贝数减少时，T-DNA转移效率显著降低，甚至不能起到提高植物转化效率的作用。同时，根据本申请说明书和对比文件2的信息可知，pRi质粒T-DNA的右边界中发挥T-DNA转移作用的TSS拷贝数应该为16或17个拷贝。因此，在本申请仅证实了18×TSS序列（即18个拷贝SEQIDNO.6）的植物转化载体可提高转化效率，并没有对其他不同拷贝数的TSS序列的功能进行验证的情况下，本领域技术人员无法确定除18×TSS序列以外的其他拷贝数TSS（尤其是2至15/16个拷贝）的SEQIDNO.6或SEQIDNO.6的全长互补序列，同样具有提高植物转化效率的功能。因此权利要求1得不到说明书支持，不符合专利法第26条第4款的规定。
3、复审请求
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于年6月23日向国家知识产权局提出复审请求，并修改了权利要求，将权利要求1中的“包含两个”修改为“包含六个”，将“SEQIDNO:6的全长互补序列”修改为“六个或更多个拷贝的SEQIDNO:6的全长互补序列”。
复审请求人认为：本申请说明书中提供了对于预测本申请的构建体提高植物转化效率的事实根据的说明，说明书第12页第2段中提到“对包含不同数目超驱动或者TSS序列的构建体效用进行比较的转化研究表明，通过提高转化频率和提高所产生的转基因事件的质量，这些序列附加的叠加拷贝的存在提高了转化效率。”说明书第24页最后一段：“包含叠加的增强子序列的构建体的使用导致了转化频率在统计学上的显著增加。用这些构建体也获得了更高百分比的优质TF（转化频率）。优质TF结合了TF和具有一个或两个拷贝事件。同样，具有一个或两个拷贝的事件百分比也增加了。”因此，修改后的权利要求1及其从属权利要求可以得到说明书的支持。
4、前置审查
经形式审查合格，专利复审委员会于年7月17日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。原审查部门坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
5、合议组审理
合议组认为：权利要求1要求保护一种提高根瘤菌介导的植物转化效率的方法，说明书中仅是泛泛记载了关于SEQIDNO：6的转化增强子序列，没有证据表明六个拷贝的SEQIDNO：6或六个或更多个拷贝的SEQIDNO：6的全长互补序列都可以有效提高根瘤农杆菌的转化效率。本申请实施例仅证实了具有18×TSS（即18个拷贝SEQIDNO：6）的RB的植物转化载体pMON，可提高根瘤农杆菌转化效率，并没有对其他不同拷贝数的TSS序列及其互补序列的功能进行验证。并且，本申请说明书也未记载18×TSS序列提高转化效率的具体机制，如提高植物转化效率的最小结构单元，因而本领域技术人员无法确定能够提高植物转化效率的最小TSS拷贝数为6个拷贝。根据对比文件2可知，并非任意拷贝数的8bp重复单元TSS序列均可以起到提高植物转化效率的作用，将天然发根农杆菌质粒T-DNA区右边界存在的TSS重复序列拷贝数减少时，T-DNA转移效率显著降低，甚至不能起到提高植物转化效率的作用。在没有实验证实的情况下，本领域技术人员不能合理预期有效的TSS拷贝数。因此，权利要求1得不到说明书的支持。
复审请求人认为：说明书已经证明，在本申请中将来自不同农杆菌种和不同*性质粒的多个拷贝的转化增强序列进行组合或替换以获得提高的转化效率和质量的技术效果，说明书中还提供了对于预测本申请的构建体提高植物转化效率的事实根据的说明。例如，说明书第12页第2段中提到：“对包含不同数目超驱动或者TSS序列的构建体效用进行比较的转化研究表明，通过提高转化频率和提高所产生的转基因事件的质量，这些序列附加的‘叠加’拷贝的存在提高了转化效率。”说明书第24页最后一段“包含叠加的增强子序列的…也增加了”。因此，根据说明书中的教导，本领域技术人员可以预期多个拷贝的TSS序列可以用于提高植物转化的效率。对比文件2中明确地描述了在植物转化载体中存在6个拷贝的TSS序列时观察到了高水平的T-DNA转移，本领域技术人员可以合理预期最少6个拷贝的TSS序列足以实现提高植物转化效率的技术效果，因此，权利要求1可以得到说明书的支持。
6、复审决定
专利法第26条第4款规定：权利要求书应当以说明书为依据，清楚、简要地限定要求专利保护的范围。根据该款规定，权利要求书中的每一项权利要求所要求保护的技术方案应当是所属技术领域的技术人员能够从说明书充分公开的内容中得到或概括得出的技术方案。如果权利要求的概括包含了申请人或请求人推测的内容，而其效果又难于预先确定和评价，应当认为这种概括超出了说明书公开的范围。
权利要求1要求保护一种提高根瘤菌介导的植物转化效率的方法，其包括：用根瘤菌转化植物细胞，所述根瘤菌包含含有至少一个来自根瘤农杆菌的T-DNA边界序列和与所述T-DNA边界序列可操作地连接的转化增强子序列的植物转化载体，其中所述转化增强子序列包含六个或更多个拷贝的SEQIDNO:6或六个或更多个拷贝的SEQIDNO:6的全长互补序列。
根据本申请说明书记载可知，本申请要解决的技术问题是提高农杆菌介导的植物转化效率的方法。说明书中记载了可以作为转化增强子的序列中包括了SEQIDNO：6，并给出了SEQIDNO：6的具体序列。说明书实施例1合成了4×超驱动序列和18×TSS序列；实施例2中构建了具有RB连同超驱动、附加的超驱动或18×TSS的载体；实施例3中用包含超驱动或者TSS增强型RB序列的载体对玉米转化，表明包含叠加的增强子序列的构建体的使用导致了转化频率在统计学上显著增加，其中载体中的TSS序列为18拷贝；实施例4中用超驱动或者TSS增强的RB序列对大豆的转化，包含叠加的增强子序列的构建体的使用导致了转化频率的增加，其中载体中的TSS序列为18拷贝；实施例5中列出了其他的增强子序列构建载体转化植物。基于上述说明书公开的内容，权利要求1所述的技术方案得不到说明书的支持，理由如下：
首先，关于涉及SEQIDNO：6的转化增强子序列，权利要求1限定了转化增强子序列包含六个或更多个拷贝的SEQIDNO：6或六个或更多个拷贝的SEQIDNO：6的全长互补序列。然而，说明书中仅是泛泛记载了关于SEQIDNO：6的转化增强子序列，没有证据表明六个拷贝的SEQIDNO：6或六个或更多个拷贝的SEQIDNO：6的全长互补序列都可以有效提高根瘤农杆菌的转化效率。本申请实施例仅证实了具有18×TSS（即18个拷贝SEQIDNO：6）的RB的植物转化载体pMON，可提高根瘤农杆菌转化效率，并没有对其他不同拷贝数的TSS序列及其互补序列的功能进行验证。并且，本申请说明书也未记载18×TSS序列提高转化效率的具体机制，如提高植物转化效率的最小结构单元，因而本领域技术人员无法确定能够提高植物转化效率的最小TSS拷贝数为6个拷贝。
其次，根据现有技术如对比文件2公开内容可知：发根农杆菌Ri质粒T-DNA区右边界存在的TSS重复序列，与根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区右边界邻近的超驱动序列，在增强T-DNA转移提高植物转化效率方面可能具有相同作用方式。不同农杆菌质粒T-DNA区右边界存在的TSS重复序列拷贝数不同，甘露碱型pRi质粒T-DNA的右边界存在6次重复的8bp序列（TSS），pRiA4质粒右边界存在5次重复的8bp序列，pRi质粒T-DNA的右边界存在16次重复的8bp序列。当将含有6个拷贝TSS序列的pRi质粒中的重复单元分别减少为5个拷贝、2个拷贝时，其T-DNA转移效率显著降低，与不含8bp重复单元序列的对照质粒（pJB8）相比，减少至5个拷贝的TSS的转化效率与对照质粒相当，减少至2个拷贝的8bp单元序列质粒（pJB）的转化效率甚至有所降低。类似的，将含有5个拷贝TSS序列的pRiA4质粒的重复拷贝数减少为2个时，T-DNA转移效率几乎与不含8bp重复单元序列的对照质粒相当。可见，并非任意拷贝数的8bp重复单元TSS序列均可以起到提高植物转化效率的作用，将天然发根农杆菌质粒T-DNA区右边界存在的TSS重复序列拷贝数减少时，T-DNA转移效率显著降低，甚至不能起到提高植物转化效率的作用。以上事实说明，在没有实验证实的情况下，本领域技术人员不能合理预期有效的TSS拷贝数。
综上所述，权利要求1请求保护的技术方案中包含了请求人推测的内容，而在现有技术的基础上，本领域技术人员无法根据说明书和权利要求书记载的内容直接得到，其效果也是难以预期的，因而权利要求1得不到说明书支持，不符合专利法第26条第4款的规定。
针对复审请求人的意见，合议组认为：本申请说明书第12页第2段仅泛泛描述了“叠加”拷贝的存在提高了转化效率，并未对叠加的TSS的具体拷贝数进行说明。同样说明书第24页最后一段记载的内容，也没有证明将天然发根农杆菌Ri质粒T-DNA的右边界中的TSS拷贝数减少时，同样具有提高植物转化效率的功能，其中表1中显示的是18×TSS序列的增强子可以提高转化频率。而“具有一个或两个拷贝的事件百分比也增加了”是载体中包含超驱动增强子的结果，与SEQIDNO：6并无直接关系。对比文件2中含有6个拷贝TSS序列的载体是pRi质粒，而本申请使用的是pMON，对比文件2中显示，在不同的载体中，可以发挥作用的TSS拷贝数是不同的，并非任意拷贝数的8bp重复单元TSS序列均可以起到提高植物转化效率的作用，将天然发根农杆菌质粒T-DNA区右边界存在的TSS重复序列拷贝数减少时，T-DNA转移效率显著降低，甚至不能起到提高植物转化效率的作用。因此，本领域技术人员无法预期在任意的载体中包含六个或更多个拷贝的SEQIDNO:6或六个或更多个拷贝的SEQIDNO:6的全长互补序列都可以提高植物转化效率。以上事实说明，在没有实验证实的情况下，本领域技术人员不能合理预期有效的TSS拷贝数。可见，复审请求人陈述的理由不具有说服力。
因此，合议组作出了维持国家知识产权局于年3月8日对本申请作出的驳回决定。
7、总结
如果权利要求的概括包含了申请人或请求人推测的内容，而其效果又难于预先确定和评价，应当认为这种概括超出了说明书公开的范围。
本申请说明书第12页第2段仅泛泛描述了“叠加”拷贝的存在提高了转化效率，并未对叠加的TSS的具体拷贝数进行说明。因此，本领域技术人员无法预期在任意的载体中包含六个或更多个拷贝的SEQIDNO:6或六个或更多个拷贝的SEQIDNO:6的全长互补序列都可以提高植物转化效率。在没有实验证实的情况下，本领域技术人员不能合理预期有效的TSS拷贝数。因此，权利要求超出了说明书公开的范围。
注：封面图片来源于网络
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