来源于《中国组织工程研究》，，25（32）
基于TMT蛋白质组学分析骨疏康胶囊治疗骨质疏松模型大鼠的机制
林若慧1，陈赛楠2，叶云金2，陈娟2，谢丽华2，*景文2，葛继荣2，李生强2通讯作者
（1福建中医药大学，福建省福州市；2福建省中医药科学院骨质疏松证候基因组学研究室，福建省福州市）
0引言Introduction骨质疏松症是一种以骨量丢失、骨组织的微小结构破坏，引起骨强度下降和骨脆性增加为特征的全身代谢性疾病，其临床表现以疼痛、脊柱弯曲为主。骨质疏松症被传统医学认为属于“骨痿”“骨枯”等范畴。目前临床中医药治疗在辨证论治的指导下具有明显的疗效和优势，能较好的改善西药治疗的药物不良反应及安全性问题。中药及中药复方有效活性成分众多，但部分化学成分尚不明确，且中药成分于复杂的机体内分泌及代谢环境中的作用机制尚不清楚。随着蛋白质组学发展迅速以及生物信息学理论的建立，逐步解决了中药复方作用机制方面检测灵敏度不高、可靠评价指标少等问题，并为中药复方治疗疾病的作用靶点研究提供了一个新的研究策略。
骨疏康胶囊是一种治疗骨质疏松症的中成药，其有服用方便、疗效稳定、不良反应小的特点，已被临床广泛应用。已有研究表明骨疏康能减少骨质疏松症小鼠的骨细胞凋亡、提高骨密度和骨矿含量，能较好的调节骨质疏松症患者骨代谢水平，改善临床症状。同时最近研究表明骨疏康可促进破骨细胞凋亡、抑制骨质疏松大鼠的骨吸收，从而延缓骨丢失和治疗骨质疏松症。但目前骨疏康治疗骨质疏松症的具体机制及作用靶点尚不明确，且基于分子水平相关研究报道较少，故仍需深入探究。此次研究利用TMT(Tandemmasstag，TMT)标记联合液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)技术研究骨疏康干预骨质疏松症大鼠腰椎的差异蛋白表达，运用生物信息学进行GO及信号通路分析，预测骨疏康治疗骨质疏松症可能的作用靶点，进一步阐释其保护骨质疏松症大鼠骨代谢的作用机制。
1材料和方法Materialsandmethods1.1设计随机对照动物实验。
1.2时间及地点实验于年9月至年9月分别于在福建省中医药科学院比较学中心和福建省中医药科学院基础研究所实验室完成。
1.3材料
1.3.1实验动物36只3月龄清洁级雌性SD大鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)-，合格证编号：78；在福建省中医药科学院比较医学实验中心继续饲养至6月龄，实验许可证号：SYXK(闽)-。各组动物在温度20-22℃，适宜湿度和光照的环境中饲养。
1.3.2实验药物、试剂与仪器骨疏康胶囊(辽宁康辰药业有限公司，国药准字：Z)，主要成分：淫羊藿、熟地*、骨碎补、*芪、丹参、木耳、*瓜籽；BCA定量试剂盒(中国碧云天)；SDT裂解液、TMT标记试剂盒(美国ThermoFisher公司)；DiscoveryW双能X射线骨密度仪(变异系数1.0CV%，精度0.25%，美国Hologic公司)；Q-Exactive质谱仪(美国ThermoFisher公司)；EasynLC色谱系统(美国ThermoScientific)。
1.4实验方法
1.4.1动物分组、造模及给药36只6月龄大鼠按照随机数字表法分成骨疏康组(n=12)、模型组(n=12)、假手术组(n=12)。根据文献方法施行大鼠双侧卵巢切除术建立骨质疏松症模型；假手术组切除卵巢旁等体积的脂肪组织。术后3d肌注青霉素80万单位/d。造模后，骨疏康组大鼠给予骨疏康灌胃[骨疏康换算后给药量为4.32g/(kg·d)，用生理盐水配成药液]，1次/d；假手术组和模型组每只给予等体积生理盐水，1次/d，连续3个月。各组给予普通饲料、自由饮水和活动。
1.4.2取材连续干预3个月后，用2%戊巴比妥钠40mg/kg注射麻醉处死各组大鼠，分离第1，2腰椎，迅速放入液氮中；取左侧胫骨用于骨密度检测；选择大鼠腰椎用于提取蛋白，并将各组每4只大鼠腰椎蛋白混合成1个样品，即每组分为3个蛋白样品用于检测。
1.4.3大鼠胫骨骨密度检测采用双能X射线骨密度仪检测各组大鼠左侧胫骨骨密度，严格按照仪器说明进行操作。
1.4.4腰椎总蛋白制备取腰椎样品加入适量SDT裂解液，沸水浴后，离心取上清液提取蛋白质。采用BCA法进行蛋白质定量后-80℃保存。
1.4.5TMT标记及肽段分级每个样品取适量蛋白质进行胰蛋白酶酶解，肽段定量(A)。按照TMT标记试剂盒说明书，每份样品分别取μg肽段进行标记后等量混合再进行分级。首先采用乙腈和0.1%三氟乙酸(TFA)进行柱平衡，然后将混合的标记肽段样品上样，将其脱盐处理、梯度洗脱、真空干燥后用适量0.1%FA复溶冻干样品，A测定肽段浓度。
1.4.6液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)采用纳升流速的HPLC液相系统EasynLC对每份分级样品进行分离；样品经色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析，正离子检测方式，母离子扫描范围-m/z。多肽和多肽碎片的质量电荷比采集方式：每次全扫描后采集20个碎片图谱(MS2scan，HCD)。
1.4.7蛋白质鉴定和定量分析LC-MS/MS质谱分析原始数据使用软件Mascot2.2和ProteomeDiscoverer1.4进行查库鉴定及定量分析。蛋白数据库为：UNIPROT_Rattus_norvegicus__0524；定量方式根据唯一肽段定量值的中位数。最大漏切数2；可变修饰有Oxidation(M)，TMT6/10plex(Y)，固定修饰Carbamidomethyl(C)，TMT6/10plex(N-term)，TMT6/10plex(K)；可信肽段的筛选标准≤0.01。
1.5主要观察指标①差异表达蛋白；②GeneOntology(GO)功能富集分析(Blast2Go软件，