白癜风咨询 http://pf.39.net/bdfyy/bjzkbdfyy/150423/4613568.html内容：讲课视频+课件+本节内容的电子书+课时作业
第一部分主要是将目的基因导入受体细胞
第二部分主要是目的基因的检测与鉴定
课件
总结
本次课内容的电子书如下：
将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化（transformation）。用什么方法将目的基因导入受体细胞呢？目前已开发出来的方法有很多种，每种方法都有其利弊，适合于不同的受体细胞。究竟选用哪种方法，要根据具体情况而定。下列介绍几种常用的转化方法。
将目的基因导入植物细胞
将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法。农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进人植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达(图1-11)。由于这种方法比较经济和有效，迄今为止，约80%的转基因植物都是通过这种方法获得的。除此之外，还有基因枪法和花粉管通道法等。
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基因枪法基因枪法（particlegun)又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。常用的金属颗粒有钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.6-4μm。这是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。
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花粉管通道法：这是我国科学家独创的一种方法。我们知道，植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA(含目的基因),使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的，花粉管通道法是一种十分简便经济的方法。
将目的基因导入动物细胞
迄今为止，显微注射技术是转基因动物中采用最多，也是最为有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法。年，世界上第一例体型比普通小鼠约大一倍的转基因“超级小鼠”就是采用显微注射技术获得成功的。基本的操作程序是：首先将含有目的基因的表达载体提纯，并使DNA浓度保持在l～3μm/mL；然后，从雌性动物体内取出卵(卵可以在体内受精，也可以在体外受精），采用显微注射仪进行显微注射（图1-12)；再将注射了目的基因的受精卵(图1-13)，经胚胎早期培养一段时间后，再移植到雌性动物的输卵管或子宫内，使其发育成为具有新性状的动物。
将目的基因导微生物细胞
由于原核生物具有一些其他生物没有的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等，因此，早期的基因工程操作都用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
目的基因的检测与鉴定
目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作，也是检査基因工程是否做成功的一步。
首先，要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键。检测方法是采用DNA分子杂交技术，即将转基因生物的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，就表明目的基因已插入染色体DNA中（图1-14)。
其次，还需要检测目的基因是否转录出了mRNA，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。检测方法同样是采用分子杂交技术，与上述方法不同之处是从转基因生物中提取的是mRNA，同样用标记的目的基因作探针，与mRNA杂交，如果显示出杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA。
最后，检测目的基因是否翻译成蛋白质。检测的方法与上述方法有所不同，是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原一抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。
除了上述的分子检测外，有时还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫或抗病特性，需要做抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度(图1-15)。又如，有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行活性比较，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。
1.作为基因工程表达载体，只需含有目的因就可以完成任务吗？为什么?
2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗?若想将一个抗病基因导入单子叶植物(如小麦)，从理论上说，你认为应该怎样做?
3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗?
4.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？
参观访问
有条件的地方，与大学或研究机构联系，参观基因工程实验室，看科研人员是怎么进行基因工程的研究和开发的。也可尝试让部分学生参与某项转基因实验，实验结束后，以讲座形式介绍给其他同学。
拓展视野
历史不能忘记中国科学家对PCR的贡献
PCR从畅想到实现，真的就是穆里斯一个人的功劳吗？其实这里也有中国人的贡献。
年，穆里斯在加州大学伯克利分校获得有机合成专业博士学位。年，进入“西特斯”(Cetus)生物技术公司任职，负责合成供实验用的寡核苷酸(短链的DNA分子)。年8月他首次在公司里做了有关PCR原理的报告，但大家反应冷淡,认为这个原理太简单了，如果可行，早就有人做了。
年公司主管向沃森推荐，使穆里斯平生第一次受邀在同年5月举行的一次“人类分子生物学”专题研讨会上做了PCR原理及实验应用的报告，这形成了先入为主的印象，即PCR是穆里斯一手发明的，为此,年穆里斯获得诺贝尔化学奖。然而，将PCR变成真正成熟技术的“临门一脚”,则是中国科学家钱嘉韵完成的，是她发现并分离了耐高温的DNA聚合酶。
钱嘉韵是我国台湾的科学家、她是第一个报道分离耐高温DNA聚合酶工作的。年钱嘉韵就读于美国俄亥俄州辛辛那提大学生物系，她的导师对*石公园里热泉中发现的嗜热菌十分好奇，他让钱嘉韵以该细菌作为研究主题。钱嘉韵不负师望，从该细菌中成功地分离了耐高温的DNA聚合酶，并于年在《细菌学杂志》上以第一作者身份发表了论文。这篇论文在科学界被广泛引用。“西特斯”公司的工作人员按照钱嘉韵等人发明的操作步骤，成功地分离了这种DNA聚合酶。由于钱嘉韵等人的工作早于穆里斯，最近几年，科学界又提出了耐高温DNA聚合酶的专利权问题，这使PCR的专利权也连带地受到了挑战。
课时作业
题组一 将目的基因导入受体细胞
1.利用现代生物科技，人们成功培育出了世界上第一例体型比普通小鼠大1.8倍的转基因“超级小鼠”。下列相关叙述正确的是()
A.将含有目的基因的DNA直接注入到小鼠体内
B.该“超级小鼠”的培育利用到了显微注射技术
C.采用的受体细胞是雌性动物的卵细胞
D.目的基因导入受体细胞前不用提纯
答案B
解析 转基因“超级小鼠”的培育过程为：首先将含有目的基因的表达载体提纯，然后利用显微注射技术将含目的基因的表达载体导入受精卵，经胚胎早期培养一段时间后，再移植到雌性动物的输卵管或子宫内，使其发育成为具有新性状的动物。
2.基因工程中因受体细胞不同，目的基因导入的方法也不同，下列叙述不正确的是()
A.将目的基因导入棉花细胞内常用花粉管通道法
B.将目的基因导入老鼠细胞内常用显微注射技术
C.将目的基因导入大肠杆菌内常用感受态细胞转化法
D.将目的基因导入小麦细胞内常用农杆菌转化法
答案D
解析 小麦是单子叶植物，其受损伤后不能分泌酚类物质，不能吸引农杆菌移向伤口处，细胞不能完成转化。
3.下列关于目的基因导入微生物细胞的叙述中，不正确的是()
A.常用原核生物作为受体细胞，是因为原核生物繁殖快，且多为单细胞，遗传物质相对较少等
B.受体细胞所处的一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态称为感受态
C.感受态细胞吸收DNA分子需要适宜的温度和酸碱度
D.常用生理盐水处理细胞，使其处于感受态
答案D
解析 因为原核生物繁殖快，且多为单细胞，遗传物质相对较少，故常用原核生物作为受体细胞，A正确；Ca2＋处理后细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态称为感受态，感受态细胞吸收DNA分子需要适宜的温度和酸碱度，B、C正确；常用Ca2＋处理细胞，使其处于感受态，D错误。
4.中美科学家通过改变一种名为NR2B的基因研制出了转基因超级小鼠Hobbie－J，Hobbie－J比普通老鼠更加聪明，大脑运转更加迅速，它能够轻松完成迷宫任务。下列关于Hobbie－J产生过程的描述，错误的是()
A.NR2B基因可通过PCR技术进行扩增
B.改变后的NR2B基因作为目的基因，可直接注入小鼠受精卵内
C.通常采用显微注射技术将改变后的NR2B基因重组质粒导入小鼠受精卵内
D.可采用基因探针检测改变后的NR2B基因是否导入小鼠体内
答案B
解析 PCR技术可在体外大量扩增目的基因，A正确；改变后的NR2B基因作为目的基因，需要与载体结合后才可导入小鼠受精卵内，B错误；将目的基因导入动物细胞常用显微注射技术，C正确；可采用基因探针检测改变后的NR2B基因是否导入小鼠体内，D正确。
题组二 目的基因的检测与鉴定
5.应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到探测疾病的目的。基因探针是指()
A.用于检测疾病的医疗器械
B.用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子
C.合成β-珠蛋白的DNA
D.合成苯丙羟化酶的DNA片段
答案B
解析 基因探针是具有特定序列的单链DNA，作用是能检测是否含有目的基因，运用了DNA分子杂交技术；基因探针＝含有目的基因的DNA片段＋放射性同位素标记。
6.在检测抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子水平的是()
A.观察害虫吃棉叶是否死亡
B.检测目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带
C.检测目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带
D.检测目的基因表达产物蛋白质能否与相应的抗体形成杂交带
答案 A
解析 A项属于个体生物学水平的鉴定；B、C两项为分子水平的检测，分别利用DNA分子杂交技术、分子杂交技术，观察目的基因及目的基因转录形成的mRNA能否与DNA探针进行杂交形成杂交带；D项也为分子水平检测内容，利用抗原—抗体杂交的原理，检测基因表达产物能否与相应的抗体形成杂交带。
7.利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是()
A.棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因
B.大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA
C.山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列
D.酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白
答案D
解析 基因表达的产物是蛋白质，因此，只有在受体细胞中检测或提取到了相应蛋白质才能证明目的基因在受体细胞中完成了表达，A、C项只能说明完成了目的基因的导入，B项只能说明完成了目的基因的导入和目的基因的转录过程。
题组三 基因工程基本程序整体分析
8.下列有关基因工程的叙述，正确的是()
A.基因工程所用的工具酶是限制酶和DNA聚合酶
B.所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列
C.选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快
D.只要目的基因进入了受体细胞就能成功地实现表达
答案C
解析 基因工程所用的工具酶是限制酶和DNA连接酶，A错误；限制酶能够识别某种特定的核苷酸序列，并在特定位点切割磷酸二酯键，但不是所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列，B错误；细菌作为受体细胞原因有多个，如细胞体积小、繁殖周期短、遗传物质少等，C正确；目的基因进入受体细胞中，由于操作失误和不可预测的干扰等，并不是所有受体细胞都能按照预先设计的方案进行重组和表达，真正能有效表达的只是一小部分，D错误。
9.蓝藻拟核DNA上有控制叶绿素合成的chlL基因。某科学家通过构建该种生物缺失chlL基因的变异株细胞，以研究chlL基因对叶绿素合成的控制，技术路线如下图所示。下列相关叙述错误的是()
A.①②过程应使用不同的限制性核酸内切酶
B.①②过程都要使用DNA连接酶
C.终止密码子是基因表达载体的重要组成部分
D.若操作成功，可用含红霉素的培养基筛选出该变异株
答案C
解析 限制性核酸内切酶有特异性，①②过程要切割的DNA序列不同，故应使用不同的限制性核酸内切酶；DNA连接酶的作用是连接被切开的磷酸二酯键，使chlL基因、红霉素抗性基因与质粒结合；基因表达载体由目的基因、启动子、终止子和标记基因等组成，终止密码子是mRNA上密码子的一种，表示一次翻译的结束；变异株中chlL基因被重组基因替换，重组基因中有红霉素抗性基因，故可用含红霉素的培养基筛选出该变异株。
10.番茄叶片受害虫的损伤后，叶肉细胞迅速合成蛋白酶抑制剂，抑制害虫的消化作用。人们尝试将番茄的蛋白酶抑制剂基因导入玉米，以对付猖獗的玉米螟。下图为培育转基因抗虫玉米的流程图，下列描述正确的是()
A.用限制性核酸内切酶切割番茄的DNA得到的产物就是蛋白酶抑制剂基因
B.用氯化钙处理玉米受体细胞，有利于含目的基因的重组质粒导入
C.重组Ti质粒应有RNA聚合酶识别和结合的部位，以启动蛋白酶抑制剂基因的转录
D.若将目的基因导入玉米花粉细胞，通过花药离体培养可获得稳定遗传的转基因玉米
答案C
解析 目的基因是用限制性核酸内切酶将DNA酶切后得到的，需筛选；氯化钙用于处理细菌细胞；基因成功表达的前提是能转录和翻译，转录时需RNA聚合酶识别转录的起点才能启动；花药离体培养得到的是玉米的单倍体，需再用秋水仙素处理单倍体，使染色体加倍才能得到稳定遗传的转基因玉米。
11.下图表示细胞膜上乙酰胆碱(一种神经递质)受体基因的克隆技术操作过程，下列相关分析正确的是()
A.获得该mRNA的最佳材料是受精卵
B.构建基因表达载体最可能使用的载体是大肠杆菌
C.完成过程①②必不可少的酶分别是逆转录酶、DNA聚合酶
D.探针筛选的目的是淘汰被感染的细菌，获得未被感染的细菌
答案C
解析 该受体基因在神经细胞中表达，获得该mRNA的最佳材料是神经细胞，A错误；构建基因表达载体最可能使用的载体是质粒，B错误；探针筛选的目的是检测是否存在cDNA，D错误。
12.年1月30日，加拿大食品检验局批准了第三种耐褐变转基因苹果品种上市。研究人员通过RNA沉默技术，特异性降低苹果细胞内多酚氧化酶基因的表达水平，使苹果被切开后即使长时间暴露在空气中也不会被氧化褐变。如图是此过程原理示意图，下列有关叙述错误的是()
A.细胞内多酚氧化酶基因的表达包括图示中的①②过程
B.将目的基因成功导入苹果细胞中需限制酶、DNA连接酶和RNA聚合酶
C.“RNA沉默”的含义是mRNA不能翻译产生多酚氧化酶
D.目的基因的表达序列与多酚氧化酶基因的表达序列互补，且要同时在同一细胞内表达
答案B
解析 图示中的①②过程分别为转录、翻译，多酚氧化酶基因的表达指多酚氧化酶基因控制多酚氧化酶合成的过程，需要经过转录、翻译两个过程，A项正确；将目的基因成功导入苹果细胞中需要构建基因表达载体，该过程需要限制酶和DNA连接酶，不需要RNA聚合酶，B项错误；据图可知，目的基因转录形成的mRNA可以和多酚氧化酶基因转录形成的mRNA互补配对，形成RNA双链，使mRNA不能与核糖体结合，从而阻止了翻译过程，C项正确；使目的基因转录形成的mRNA和多酚氧化酶基因转录形成的mRNA互补配对，应使目的基因的表达序列与多酚氧化酶基因的表达序列互补，且要同时在同一细胞内表达，D项正确。
13.(·海南，31)基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题：
(1)在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即____________和从____________中分离。
(2)利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是___________________
_________________________________________________________________________。
(3)在基因表达载体中，启动子是______________识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是____________。
(4)将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有________和________颗粒。
答案 (1)人工合成 生物材料
(2)cDNA文库中只含有叶细胞已转录(或已表达)的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因
(3)RNA聚合酶 大肠杆菌(或细菌)
(4)金粉 钨粉
解析 (1)获取目的基因主要有两大途径，即人工合成和从自然界已有的物种中分离。(2)在植物的成熟叶片中基因选择性表达，因此由所有RNA反转录形成的cDNA文库中只含有叶细胞已转录(或已表达)的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因。(3)在基因表达载体中，启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位。采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，由于易于培养，最常选用大肠杆菌(或细菌)。(4)将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有金粉和钨粉颗粒。
14.如图是获得转基因抗虫棉的技术流程示意图。
请回答：
(1)A→B利用的技术称为________，其中②过程需要热稳定的________________酶才能完成。
(2)图中将目的基因导入棉花细胞需要经过③过程，该过程为构建______________，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在且可以遗传给下一代，并能表达。
(3)上述流程示意图中，将目的基因导入棉花细胞所采用的方法是________________法，该方法一般__________(填“适宜”或“不适宜”)用于将目的基因导入单子叶植物。
(4)欲确定抗虫基因在G体内是否表达，在个体水平上需要做__________实验。如果抗虫基因导入成功，且与某条染色体的DNA整合起来，该转基因抗虫棉可视为杂合子，将该转基因抗虫棉自交一代，预计后代中抗虫植株占________。
答案(1)PCRDNA聚合(Taq)(2)基因表达载体 (3)农杆菌转化 不适宜 (4)抗虫接种 3/4
解析 PCR技术需要用到热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)。图中③过程为构建基因表达载体，将目的基因导入棉花细胞所采用的方法是农杆菌转化法，农杆菌对大多数单子叶植物没有感染能力。欲确定抗虫基因在体内是否表达，在个体水平上应做抗虫接种实验。由于抗虫基因只整合到一条染色体DNA上，则该抗虫棉产生的配子只有一半含有抗虫基因，雌雄配子随机结合，后代抗虫植株占3/4。
15.大肠杆菌pUC18质粒是基因工程中常用的载体。某限制酶在此质粒上的唯一酶切位点位于LacZ基因中，如果没有插入外源基因，LacZ基因便可表达出β-半乳糖苷酶。当培养基中含有IPTG和X－gal时，X－gal便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。反之，则形成白色菌落。下图表示利用此质粒实施基因工程的主要流程。请分析并回答下列问题：
(1)对已获得的目的基因可利用______________技术进行扩增。
(2)目的基因插入质粒构建重组质粒的过程中，需要DNA连接酶恢复____________键。
(3)将试管Ⅰ中的物质和大肠杆菌共同置于试管Ⅱ的目的是________________；大肠杆菌需事先用Ca2＋进行处理，目的是_________________________________。
(4)将试管Ⅱ中的菌液接种于选择培养基上培养，培养基中应含有大肠杆菌必需的营养物质_________________________和生长因子，还应加入IPTG、X－gal以及氨苄青霉素，其中加入氨苄青霉素的作用是筛选出______________________。
(5)若观察到培养基上出现________色菌落，则说明大肠杆菌中已成功导入了重组质粒。如果作为受体细胞的大肠杆菌也含有LacZ基因，则不利于重组质粒的筛选，原因是
______________________________________________________________________。
答案(1)PCR(2)磷酸二酯
(3)进行转化 使大肠杆菌细胞处于感受态
(4)碳源、氮源、无机盐、水 导入pUC18质粒的大肠杆菌
(5)白 无论大肠杆菌中是否导入重组质粒，均会呈现蓝色菌落，无法判断导入的是原PUC18质粒还是重组质粒
解析 (1)PCR技术是一种体外扩增目的基因的方法。(2)DNA连接酶的作用是催化磷酸二酯键的形成。(3)将试管Ⅰ中的物质和大肠杆菌共同置于试管Ⅱ的目的是进行转化；大肠杆菌需事先用Ca2＋进行处理，使其转变为一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态——感受态。(4)培养基中应含有大肠杆菌必需的营养物质，包括碳源、氮源、无机盐、水和生长因子等。氨苄青霉素抗性基因作为标记基因，作用是筛选出导入pUC18质粒的大肠杆菌。(5)若观察到培养基上出现白色菌落，则说明大肠杆菌中已成功导入了重组质粒。如果作为受体细胞的大肠杆菌也含有LacZ基因，则无论大肠杆菌中是否导入重组质粒，均会出现蓝色菌落，故不利于重组质粒的筛选。
cuisanyingzi
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